La mulattiera non può stare nella zona di tutela assoluta, è ovvio, perchè recintata e di proprietà dell'ente gestore. Però nulla vieta che ricada nella zona di rispetto ristretta o nella zona di rispetto allargata.
Se quello studio dovessi farlo io non farei nè prove Lefranc ne cose simili a scala di forellino. L'unica (modesta) possibilità che la tua pista ha di interferire con la sorgente può essere di tagliarne l'alimentazione da monte, per diretta interferenza tra la falda e scavi profondi in trincea e a mezzacosta. Visto che la mulattiera non modificherà in modo così significativo il profilo originale del terreno, credo che la risposta al problema ti possa venire da un semplice rilevamento a scala molto locale delle condizioni di affioramento delle acque. Es. siamo in un'area di risorgenze areali diffuse? Ci sono sorgenti immediatamente a monte di composizione analoga a quella a valle di cui ti stai occupando (es. controlla la conducibilità elettrica delle acque)? il tracciato della pista taglia un lembo detritico che maschera la risorgiva reale dal substrato, e in cui ci può essere un acquifero locale a falda libera? ....
Cerca di definire lo schema concettuale e funzionale della sorgente, e sovrapponi poi a questo il tracciato della pista....
L'elaborato può essere il commento di una sezione geologica-idrogeologica a scala locale(o più di una se occorre), con indicazione anche della mulattiera, in cui viene evidenziata l'eventuale interferenza diretta sull'acquifero. Con questo ti eviti la figura, mai bella, di proporre indagini complesse e onerose per un problema che probabilmente non sussiste e arrivi comunque ad una conclusione ben documentata e comprensibile anche ai non tecnici.